诱导CtsR调控提高枯草芽孢杆菌的木聚糖酶产量-绍鑫网

　　由于其高效的蛋白质分泌能力，枯草芽孢杆菌被广泛用于酶的商业生产。然而，不同酶的分泌效率差异很大，尽管经过多年的研究，酶生产的优化在很大程度上仍然是一个反复试验的问题。全基因组转录组分析似乎是识别相关分泌瓶颈的有用工具，但迄今为止，仅发表了有限数量的转录组研究，重点关注枯草芽孢杆菌的酶分泌。在这里，我们使用RNA-seq检测了商业上重要的酶内切-1,4-β-木聚糖酶XynA的高水平表达对枯草芽孢杆菌转录组的影响。

　　使用新的基因集分析工具GINtool，我们发现当XynA过量产生时，CtsR调控子的活性降低。该调控由几个蛋白伴侣基因组成，包括clpC、clpE和clpX，并受转录抑制控制。CtsR水平受受调节的蛋白水解直接控制，包括ClpC及其同源蛋白酶ClpP。当我们通过灭活抑制因子CtsR来消除这种负反馈时，XynA的产量增加了25%。

　　酶的过量生产可能会减少枯草芽孢杆菌中Clp蛋白伴侣的数量，这可能是由于负反馈调节。打破这种反馈可以提高酶的产量。考虑到Clp伴侣及其调控的保守性，这种方法可能有利于其他生物的高产酶生产。

　　由于其优越的酶分泌能力和使用安全，枯草芽孢杆菌及其近亲被广泛用于洗涤剂、食品、造纸和制药行业的酶的工业规模生产[1,2,3,4]。许多遗传策略已被应用于优化枯草芽孢杆菌菌株生产外源蛋白，包括使用强启动子，优化核糖体结合序列，灭活其主要的细胞外蛋白酶[5,6,7,8,9]。通常接下来是筛选最佳分泌信号肽[10,11]，有时通过增加某些蛋白质伴侣的水平，如细胞质伴侣DnaK或细胞质外伴侣PrsA[12,13]。然而，枯草芽孢杆菌在高水平下可以产生的酶的范围仍然有限，产量差异很大[1,14]。由于生产瓶颈通常是酶特异性的，使用全基因组转录组分析是识别它们的有力方法。然而，只有数量有限的转录组研究专注于识别芽孢杆菌物种生产商业酶的瓶颈[15,16,17,18,19,20]。这些研究中观察到的主要分泌应激标志物之一是膜相关质量控制蛋白酶HtrA/B的上调[15,16,17,18,21]。然而，去除HtrA/B通常会降低天然蛋白和异源蛋白的分泌能力[22,23]，据我们所知，这些研究都没有导致修饰导致分泌改善。在这里，我们使用RNA-seq分析揭示了枯草芽孢杆菌过量生产具有商业意义的内源性1,4-β-木聚糖酶XynA的可能限制步骤。

　　XynA是一种内源性23 kDa分泌蛋白，可催化木聚糖中1,4-β-d-木质素键的水解[24,25]。该酶用于许多过程，包括造纸工业的木浆漂白，纺织工业的退浆和生物洗涤，烘焙工业的面团质量改善以及家禽的食品添加剂[26]。我们对从不同生长阶段收集的过表达XynA的细胞进行了RNA-seq，并使用了内部开发的软件工具Gintool来促进基因集富集分析，同时尊重了调控基因相互作用的方向性[27]。这揭示了Clp蛋白伴侣蛋白的意外下调。诱导这些伴侣蛋白的表达可使XynA的产量提高25%。

　　为了确保在相关条件下进行RNA-seq分析，我们首先测量了枯草芽孢杆菌生产菌株培养过程中培养基中XynA的积累情况。通过无标记清洁删除程序去除原生xynA基因[28]，以确保阴性对照菌株不产生任何xynA。XynA的过表达是通过将XynA克隆到多拷贝表达质粒pUB110中，在强amyQ启动子后面，并带有自己的(天然的)信号肽[29,30]。作为阴性对照，我们使用相同的质粒缺乏xynA基因。将菌株置于富含营养的LB培养基中，在50 μg/mL卡那霉素的存在下，37℃培养以维持质粒。在生长过程中定期取样，用荧光酶活性测定法测定培养基中的木聚糖酶活性。如图1a所示，XynA的过表达不影响生长速度，在对数生长期的中途，XynA开始在培养基中积累，并在过渡到生长平稳期约1 h后达到峰值(图1b)。生产持续了大约6小时。为了进行RNA-seq分析，在3小时(T1, OD600 ~ 0.8)和6小时(T2, OD600 ~ 4)时取样。

　　枯草芽孢杆菌木聚糖酶生产谱。BWB09/pCS58 (Xny)和对照菌株BWB09/pBW17 (Emp)的酶活性和生长曲线。箭头表示从对数相到平稳相的过渡。B生长过程中酶分泌动态，用酶活性变化(Δ mU/mL)每2 h表示。RNA分离的采样次数用箭头表示(T1为3 h时OD600 ~ 0.8, T2为6 h时OD600 ~ 4.0)

　　RNA-seq数据基于两个独立的生物复制。主成分分析(PCA)显示，样本聚类主要基于采样时间(图2a)，考虑到分别采集3 h和6 h样本的对数生长阶段和平稳生长阶段之间的巨大差异，这并不奇怪。图2b、c的火山图显示了上调和下调基因的分布，表明XynA的过量生产改变了大量基因的表达，尤其是在固定期。以p值< 0.05为阈值时，对数期和平稳期样品中分别鉴定出102个和233个差异表达基因。在两个时间点中，只有25个基因受到影响(图2d)。为了关注最相关的基因，我们进一步对3小时样本应用了两倍变化的阈值，对6小时样本应用了< -3或> 3倍变化的阈值。这些基因分别列在表1和表2中(所有基因的列表见附加文件1:表S1)。

　　过表达XynA枯草芽孢杆菌细胞RNA-seq数据的全局比较。在对数生长(3 h)和平稳生长(6 h)时，比较了分泌菌株(Xyn)和含有空质粒(Emp)的对照菌株的数据。两个生物重复的主成分分析(PCA)。Emp3h和Emp6h为对照菌生长3和6h时的空质粒rna测序样本，Xyn3h和Xyn6h为Xyna分泌菌株的rna测序样本。最大的样本变化是由不同的生长阶段(PC1, 3 h和6 h)引起的，PC1时间点之间的差异对于Xyn和Emp样品都是一致的。B, C XynA过表达诱导的差异表达基因(DEGs)在3 h和6 h的火山图(BWB09/pXynA vs. BWB09/pEmp)。虚线表示p值为0.05。显著上调和显著下调基因(p值< 0.05)分别用红色和绿色表示。在3 h(蓝色)和6 h(黄色)XynA分泌胁迫下显著上调和下调基因数量(p值< 0.05)的D维恩图

　　对表1和表2中基因的初步分析并没有显示出明显的分泌瓶颈，例如诱导膜锚定蛋白质量控制蛋白酶HtrA/B。唯一与分泌相关的作用是信号识别颗粒SRP的4.5 S RNA组分scr在6小时内的强烈下调(表2)[31]。编码SRP蛋白亚基的ffh的表达未受显著影响(附加文件1:表S1)。我们有理由认为，XynA与大多数分泌蛋白一样，使用依赖seca的分泌途径，而不是共翻译SRP途径，因为SRP主要用于跨膜蛋白插入细胞膜[31]。当我们通过整合由强木糖诱导的Pxyl启动子驱动的额外拷贝来增加scr的表达[32]时，培养基中的XynA水平没有增加(附加文件3:图S1)，这表明scr水平的降低并没有限制XynA的分泌。

　　用于选择最相关的差异表达基因的阈值是任意的。因此，有用的基因调控信息可能会丢失。因此，使用基于功能类别和/或调控子信息的基因集富集分析可以帮助分析转录组数据，而无需使用截止值预先选择基因。为了便于分析，我们开发了Excel插件GINtool[27]，并使用了枯草芽孢杆菌主要知识数据库Subtiwiki中随着时间的推移收集的功能类别和规则信息[27,33]。首先，我们关注与应激、蛋白质翻译和蛋白质稳态相关的功能类别，并基于表1和表2中的基因，还包括与呼吸、硫和碳代谢以及氨基酸利用相关的功能类别。如图3所示，在3h时间点上上调的氨基酸合成和获取基因比表1中所列的要多得多。与表2的信息相比，6 h样品中呼吸基因的下调更为明显。有趣的是，在这两个时间点上，“伴侣蛋白和蛋白质折叠”的功能类别都下调了。这一类包括保守蛋白伴侣蛋白GroEL/ES, DnaJ/K等，但由于选择了折叠变化的截止值，其相关基因未在表1和表2中显示。“一般应激蛋白”类别，包括161个Sigma-B控制基因，在XynA过度表达的细胞中似乎没有被激活，但“热休克蛋白”似乎在两个样本中都被下调。在3小时的样品中，“蛋白质分泌”功能类别中的几个基因略有上调。这一类基因涉及包括一般分泌在内的多种过程，如编码Sec和信号肽酶的基因，但也包括编码Tat分泌系统和产孢过程的基因。事实上，这类基因中最强烈(2- 3倍)的诱导基因是产孢操纵子spoIIIAB，它参与了产孢sigma因子sigma - g的激活(附加文件1:表S1)[34,35]。

　　功能类分布图。基因的Log2倍变化值(FC)沿x轴绘制。每个功能类别的基因数量用括号表示。每个类别的上下两组柱状图分别代表3小时和6小时的样本，如硫代谢类别的黑色箭头所示

　　通常，功能类别包括由不同调节因子控制的基因。例如，下调的功能类别“热休克蛋白”包括27个基因，其中包括由sigma因子SigI调控的一般热应激基因，由CssR调控的膜锚定蛋白质量控制蛋白酶基因htrA/B，由CtsR调控的Clp AAA +展开酶编码基因，以及由HrcA调控的GroEL/ES和DnaJ/K编码基因[33]。因此，为了更好地理解是什么调控导致了所观察到的转录差异，关注调控是有用的。到目前为止，已鉴定出218条枯草芽孢杆菌的调控[33]。当这些规则根据其平均折叠变化值进行排序时，可以观察到明显的活动梯度(附加文件3:图S2)，与基于任意折叠变化和p值阈值水平的二进制、相关/不相关分布相比，呈现出更自然的差异表达视图。

　　GINtool可以根据褶皱变化的平均绝对偏差(MAD)绘制规则的平均褶皱变化[27]。MAD值表明了一个调控子中基因的表达差异有多均匀，有助于直观地呈现调控子的活性(图4a)。附加文件2:表S2中列出了所有规则的GINtool分析结果。在3 h和6 h样品中受XynA过表达影响最大的调控是CcpA调控。CcpA是枯草芽孢杆菌主要的分解代谢抑制物[36]。第二大调控子是出现在6小时样本中的AbrB调控子，它是过渡状态基因在固定期变得活跃的关键转录调控子[37]。在图4a中，这些调控具有正的平均折叠变化值，这意味着当XynA过表达时，CcpA和AbrB更被激活。然而，重要的是，由于这些调节因子主要作为转录抑制因子起作用，这些调节因子中的许多基因实际上在XynA过表达时下调。GINtool为这些调控的平均倍数变化赋正的原因是，当该信息可用时，该程序考虑了调控的方向性(激活/抑制)[27]。这些信息对于计算相关的平均折叠变化至关重要，对于枯草芽孢杆菌，这些信息也可以在Subtiwiki数据库中找到[33]。调控的方向性之所以重要，是因为调控因子可以同时作为某些基因的抑制因子和其他基因的激活因子。例如，枯草芽孢杆菌应答调节因子Spo0A抑制104个基因，激活63个基因[33]。这意味着仅仅平均一个调控子的基因的折叠变化并不能给出调控子活性的精确近似。

　　规则气泡图。平均折叠变化(av-FC)与折叠变化(MAD av-FC)的平均绝对偏差在3小时(左)和6小时(右)的样本中绘制。B在3小时(左)和6小时(右)的样本中，与最可能的调控相对应的调控基因的比例对应的平均折叠变化。气泡大小表示调控基因的数量。颜色强度表示该调控子中基因从暗到亮的平均p值，平均p值分别为< 0.0625、< 0.125、< 0.25、< 0.5。为清楚起见，未显示平均p值≥0.5的规则。值得注意的是，平均折叠变化、MAD、p值和气泡大小是基于与调节剂最有可能的活性状态相对应的调控基因。这种状态，要么被激活，要么被抑制，是基于最大比例的调节基因，这些基因显示出与这两种活性状态之一相对应的折叠变化。CtsR规则用红色表示

　　GINtool通过计算表现出与调节剂最有可能的活性状态相对应的折叠变化的调控基因的比例来估计激活或抑制的可能性[27]。如图4b所示，有许多调控在XynA过表达后表现出一致(100%)的活性变化。这些调节大多与糖代谢有关(附加文件2:表S2)，这些过程如何阻碍XynA的产生目前还不清楚。然而，在这个列表中有一个有趣的调控子，CtsR调控子，除了它自己的基因外，它还包括编码基因clpE、clpC和clpX的AAA +展开酶，以及编码clpP基因的相关蛋白酶亚基。通常，这些蛋白的表达与诸如热休克后发生的错误折叠蛋白的存在有关[38]。然而，蛋白质的强烈过表达也会导致错误折叠蛋白水平的增加，因此令人惊讶的是，clp基因在XynA过表达时集体下调。

　　CtsR是一种转录抑制因子，其浓度受蛋白水解调控。适配体McsB激酶特异性结合并靶向CtsR，使其被ClpCP蛋白酶复合物降解[39,40]。热休克或氧化应激影响CtsR的DNA结合活性，触发McsB的激活[41,42,43]。据推测，在XynA生产过剩的条件下，ClpCP系统忙于处理未折叠或错误折叠的XynA，而没有足够的时间参与CtsR蛋白水解。这将导致CtsR水平升高，随后clpCP表达下调，从而进一步加强这种负反馈循环。这也许可以解释为什么我们观察到CtsR调节下调。我们可以合理地假设，Clp伴侣蛋白水平的增加会降低错误折叠蛋白的水平，这可能有助于增加XynA的产生。为了验证这一点，我们构建了ctsR缺失菌株并测量了XynA的产量。如图5所示，?ctsR突变体的生长速度正常，但XynA的分泌量比野生型高出约25±5%。综上所述，通过去除CtsR抑制因子来诱导CtsR调控可以提高XynA的产生。

　　?ctsR缺失菌株的XynA产量。BWB09/pCS58野生型(wt)和SGB03/pCS58缺失型(ctsR)菌株在生长过程中产生XynA。给出了3个独立实验的平均值和标准差。B从10小时的上清样品中沉淀的蛋白质的考马斯氏染色。左侧显示分子量。星号表示上清样品中的XynA蛋白带。左边的条形图代表三个重复的考马斯氏染色凝胶的蛋白质密度定量

　　本研究发现，XynA在枯草芽孢杆菌中过表达可下调CtsR调控。这一结果并没有出现在较早发表的XynA过表达枯草芽孢杆菌的转录组研究中[18]。当我们将本研究的数据与我们的数据进行比较时，通过选择所有表现出2倍或更多表达变化且p值< 0.05的基因，我们发现只有9个基因表现出可比较的表达差异(附加文件3:图S3)。其中包括异亮氨酸生物合成基因ilvB和dppB的上调，以及美利二糖利用melR操纵子和编码细胞色素c氧化酶亚基IV的ctaF基因的下调。在另一项研究中，观察到膜相关蛋白质量控制蛋白酶HtrA/B和伴侣蛋白GroEL/ES的上调[18]，但我们没有观察到。然而，这些差异和调控基因缺乏重叠可以用不同的实验条件来解释。在之前的研究中，XynA在对数生长结束后仅诱导表达30分钟，之后提取RNA样品，而在我们的系统中，XynA从组成活性强的amyQ启动子连续表达[30]。

　　在我们的研究中，我们只发现了一个与分泌直接相关的特征，那就是SRP的RNA成分scr水平的显著下降。对于大肠杆菌，研究表明，scr浓度降低会导致SRP蛋白成分Ffh的稳定性降低，并损害SRP依赖性易位[44,45]。XynA不太可能使用SRP分泌，因为蛋白质分泌到培养基中通常依赖于SecA途径[46,47]，但由于SRP和SecA途径都使用相同的Sec易位复合体，因此SRP系统受损可能间接影响XynA的最佳分泌。然而，当我们从强木糖诱导启动子中表达额外的scr拷贝时，没有观察到XynA产量的改善。虽然，我们没有解释为什么在XynA过表达的细胞中scr浓度下降，但很明显，较低的scr水平并没有限制XynA的产生。

　　枯草芽孢杆菌大量生产XynA会影响多种调控的活性，包括呼吸、铜吸收、毒素保护、糖利用和孢子形成调控。这些调节都不能在功能上与木聚糖酶或分泌应激联系起来。可能一些相关的调节因子也受调节蛋白水解的控制，因此在高XynA生产条件下更活跃。值得注意的是，早期的产孢调控诱导并没有导致早期的产孢表型(数据未显示)。

　　我们假设，在一个?ctsR突变体中，XynA产量的增加是由ClpC/E/X伴侣的水平增加和/或由它们与ClpP一起形成的蛋白质质量蛋白酶复合物引起的。有几个通过诱导伴侣蛋白表达来提高产量的例子。例如，增加触发因子和GroEL/ES的表达可增加大肠杆菌中人蛋白ORP150和人溶菌酶的产量[48]。研究表明，提高GroEL/ES和DnaJ/K-GrpE水平可提高枯草芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的产量[49]。有趣的是，groEL/ES和dnaJ/K基因由转录抑制因子HrcA控制[50,51]，该蛋白也受ClpP的蛋白水解降解控制[52]，事实上，在我们的分析中，我们确实看到了HrcA调控基因的下调(图4)。因此，CtsR的失活可能以不同的方式改善了产量，包括间接增加groEL/ES和dnaJ/K的表达。同样重要的是要记住，CtsR调节其他基因，如参与DNA修复和重组的disA和radA，编码lonA基因的atp依赖性蛋白质量控制蛋白酶，以及分别参与核糖体组装和氧化损伤保护的ysxC和trxA基因[53,54]。因此，未来的研究将有必要确定?ctsR菌株中XynA产量的提高是否直接由蛋白伴侣和Clp蛋白的质量控制活性引起。然而，由于这些蛋白质的许多调节作用，很难获得明确的证据。

　　在这里，我们展示了一种先进的基因集富集分析可以揭示有用的信息，如果使用主观阈值来选择感兴趣的基因，这些信息可能会被遗漏。我们的分析表明，CtsR调控的表达增加，通过去除相关的转录抑制因子，导致XynA的产生增加。由于ClpCP对CtsR的反馈控制，我们有理由认为枯草芽孢杆菌中其他蛋白质的强烈过量生产也会导致clp基因表达的减少，因此CtsR的失活也可能提高该生物中其他蛋白质的生产水平。事实上，这种方法可能适用于许多生产生物体，因为Clp蛋白和CtsR在厚壁菌中都是保守的。

　　本研究使用的菌株和质粒列于附加文件3:Table S3。采用野生型色氨酸原营养枯草芽孢杆菌168衍生物BSB1进行表达。营养培养基Luria-Bertani培养基(LB，含10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl)用于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的一般生长。根据需要添加补充物:红霉素(5μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)、大霉素(150μg/mL)、氨苄西林(100μg/mL)和木糖(Xyl, 0.5%或2%，w/v)。为了测量枯草芽孢杆菌XynA分泌谱，菌株接种后在30°C下过夜生长，以防止产孢。第二天早上，将隔夜培养物稀释到新鲜和预热的培养基中，初始OD600为0.05。在210转/分钟(37°C)摇晃下培养，并在所需的时间点取样，以进行后续的酶或蛋白质实验。我们使用100 mL的Erlenmeyer烧瓶培养10 mL的培养物，250 mL的Erlenmeyer烧瓶培养25 mL的培养物，以保证适当的曝气。培养基中加入50 μg/mL卡那霉素维持质粒。

　　对于枯草芽孢杆菌的DNA转化，使用spizizen -饥饿培养基(SMM)，含15 mM (NH4)2SO4, 80 mM K2HPO4, 44 mM KH2PO4, 3 mM柠檬酸三钠，0.5%葡萄糖，6 mM MgSO4, 0.2 mg/mL色氨酸，0.02%酪氨酸和0.00011%柠檬酸铁铵(NH4)5Fe(C6H4O7)2)，如前所述[55]。

　　用于克隆的所有引物都列在附加文件3:表S4中，所有构建物都进行了测序，以省略可能的突变。构建BWB09 (trpC+，?xynA，?amyE)。在[56]中有描述。将过量生产XynA的质粒pCS58[27]转化为BWB09。以pCS58质粒为模板扩增遗漏xynA ORF的载体主干序列。该质粒pBW17[27]作为阴性对照。

　　以pHJS103质粒为基础构建用于过表达scr的质粒pBW18[57]。从pHJS103染色体中扩增出木糖诱导启动子Pxyl和amye整合侧翼序列，从BSB1染色体DNA中扩增出含有S17-5'UTR的scr序列。随后，将两种PCR产物通过Gibson组装连接[58]，转化为大肠杆菌TOP10细胞[59]。然后分离pBW18，用限制性内切酶酶切线性化，转化到BWB06细胞中，得到scr过表达菌株SGB01。

　　将从BKE枯草芽孢杆菌基因组级缺失文库[60]中获得的?ctsR突变体的染色体DNA转化到BWB09细胞中，构建ctsR突变体SGB03。

　　RNA提取基于[61,62]中描述的方法。简单地说，在对数生长期(3 h)和固定生长期(6 h)各取2 mL细胞，将细胞球重悬于0.4 mL冷水生长培养基中，加入含有1.5 g玻璃微珠(0.1 mm)、0.4 mL苯酚/氯仿/异戊醇混合物(25:24:1)和50 μL 10% SDS的螺旋盖管中，旋涡混合，液氮速冻保存。细胞破坏是通过头部跳动实现的(Precellys 24)。离心后，将上水相RNA用乙醇沉淀，用70%的冰乙醇洗涤2次，干燥后溶于水。DNA经DNA ei (NEB)处理去除。然后进行第二轮P/C/I提取，然后进行乙醇沉淀和70%乙醇洗涤，并在水中溶解。

　　在深度测序之前，RNA样品用MICROBExpress?细菌mRNA富集试剂盒(Thermo Fisher)处理，去除大部分16S和23S rRNA。随后，根据制造商的协议，使用Illumina?(New England Biolabs)的NEBNext?Ultra?II定向RNA文库准备试剂盒，使用NEBNext?Multiplex Oligos for Illumina?(New England Biolabs)构建RNA-seq文库。测序在Illumina NextSeq 550系统上进行，使用NextSeq 500/550 High Output v2.5试剂盒(75-bp读取长度)，原始数据使用基于web的平台Galaxy进行处理。我们的目标是每个库的测序深度达到5-10百万reads[28]。Trimmomatic用于修剪适配器序列并过滤不良读数[63]。用Bowtie2将修剪后的reads与芽孢杆菌参考基因组(NC_000913)比对[64]。映射完成后，使用featucount对对齐读取进行计数[65]。使用Deseq2来确定样本之间的差异表达特征[66]。使用内部开发的软件工具GINtool分析转录组数据[27]，使用从Subtiwiki数据库获得的关于操作子、功能类别和规则的先验知识[33]。

　　取100 μL细胞移入1.5 mL Eppendorf管中，4℃下，20000 RCF离心1 min，取70 μL上清移入新管，液氮速冻保存，- 80℃保存。根据制造商的说明，使用荧光法测定上清液中的XynA酶活性EnzChek?Ultra Xylanase assay Kit (Thermo Fisher Scientific)。

　　将1 mL培养物移入1.5 mL Eppendorf管中，在4℃下，20000 RCF离心1 min，将800 μL上清小心移入含有200 μL 100% (w/v)三氯乙酸(TCA)的新管中，旋涡混合，在?20℃下沉淀过夜。样品在4℃下，20000 RCF离心20 min，用800 μL冷水丙酮洗涤，风干。将蛋白颗粒重悬于含有1mm PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)的1X SDS-PAGE上样缓冲液中。采用5分钟浴声步骤快速溶解颗粒。所有样品在95°C下变性5分钟，用14% SDS-PAGE凝胶分离。电泳后，按照Bio-Rad的方案用胶体考马斯色染色。根据培养物的光密度归一化样品装填量，每车道装填OD600为0.2对应的细胞量。图像由奥德赛Fc成像系统拍摄，并用Empiria Studio软件(LI-COR Biosciences)进行分析。